文章收录于#陈昌福专栏，点击图片查看
前不久，我们针对水产养殖动物疫病检测机构，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，检测对虾饲料中的白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）中的遗传物质——脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA，以下一律称为DNA）时，获得了阳性结果。当这种阳性检测结果被对虾养殖业者知道后，有些养殖业者立即将今年下半年养殖对虾成活率不高的现实问题，与检测结果联系起来，导致一些对虾养殖业者对已经使用的带有对虾WSSV的DNA的对虾饲料，究竟是否能传染对虾白斑综合征病毒病（white spot syndrome virus disease，WSSVD），产生了不少疑问。
为了解除对虾养殖业者的上述的疑问，我们先后在《农财宝典》微信公众平台上，发布了以下相关报道↓
在文章中介绍了PCR技术的基本原理，对虾饲料中WSSV的DNA的来源，以及饲料中存在的WSSV的DNA片段，为什么不会导致养殖对虾发生WSSVD的原因。
现在又有对虾疫病检测机构，在由对虾养殖业者送检的某饲料公司生产的对虾饲料中，采用PCR技术检测到了虾肠肝胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）的DNA片段。据说向检疫机构送检对虾饲料的对虾养殖业者，还准备以对虾饲料中检测到EHP的DNA片段的阳性结果为由，准备拒付欠下的对虾饲料生产企业的饲料款。其实，从对虾饲料中检测到EHP的DNA片段阳性结果的基本原理，是与在对虾饲料中检测到WSSV的DNA的阳性结果一样的。
在这篇小文章中，我们将在介绍EHP的部分生物学特性的基础上，再次提出不宜利用PCR等分子生物学技术，通过检测对虾饲料中可能存在的某些致病生物的DNA等遗传物质，而做出这种对虾饲料可以传播某种疾病的判断。
文 | 华中农业大学 陈昌福
EHP属于真菌界（Eumycetes）、微孢子虫门（Microspora）、单倍期纲（Haplophasea）、壶孢目（Chytridiopsida）、肠胞虫科（Enterocytozoonidae）、肠胞虫属（Enterocytozoon），是一种专性细胞内寄生生物。2000年，研究人员在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现了一种未知的微孢子虫，研究发现不同于以往已经发现的性状相近、并已经被鉴定的比氏肠胞虫（Enterocytozoon bieneusi）的寄生虫，而将其鉴定为虾肝肠孢虫新种。EHP的生活史包括感染期（infection stage）、增殖期（proliferation stage）和孢子繁殖期（period of spore propagation）等三个阶段。EHP的传播方式有两种，即垂直传播（vertical transmission）与水平传播（horizontal propagation）。所谓垂直传播就是携带有EHP的繁殖用亲虾，通过其受精卵将EHP传递给子代。已经有研究结果证明，感染EHP的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）亲虾繁殖的F1代的无节幼体、蚤状幼体第一期和第二期中，均可以检测到EHP。说明EHP的垂直传播途径的确是存在的。EHP水平传播途径相对比较复杂。迄今为止，已知健康对虾可以通过摄取携带EHP的对虾残体、与患病对虾饲养在同一个水体环境中而感染EHP。在养殖对虾的水体环境中，可能存在各种携带EHP的媒介生物，健康对虾也可能因为摄取水体中存在的携带EHP的媒介生物而感染EHP。已经有试验报告指出，健康对虾可以因为摄取携带EHP的卤虫（Brine shrimp）而感染EHP。主要危害各种对虾，如斑节对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾（Penaeus japonicus）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）等。有报道指出，由于EHP的蔓延与危害，已经致使中国、印度、泰国、马来西亚、越南、印度尼西亚等亚洲许多国家的对虾养殖业，遭受到了较大的经济损失。EHP被对虾养殖业者怀疑与养殖斑节对虾、凡纳滨对虾和罗氏沼虾的生长迟缓状态有关。EHP入侵健康对虾后，可以分布在对虾的肝胰腺、中肠、鳃、血淋巴、肌肉和心脏等各种组织与器官中。由于EHP对个器官和组织造成的损伤，导致受感染对虾血淋巴中总蛋白量和白蛋白量显著上升，可作为肝损伤指标的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶活性显著上升。感染EHP的对虾虾体质量显著低于健康对虾。养殖对虾在遭受EHP感染后，其外观难以观察出明显疾病症状。有养殖业者反应，养殖对虾感染EHP后，养殖到60d、当对虾长到120条/kg左右的规格后，就出现不上料、不长大、不生病、不死亡的现象，只是对虾规格开始出现显著差别。如果将养殖池塘中的对虾捞取一部分做规格比较的话，就可以发现养殖对虾的个体大小发生了明显差别（图1）。这种现象也成为人们认为对虾感染EHP后，能影响养殖对虾生长速度的主要证据。
图1EHP感染导致饲养对虾生长速度参差不齐的现象（图片来自网络）关于养殖对虾EHP的检测方法，我国已经发布了“中华人民共和国水产行业标准”——《虾肝肠胞虫诊断规程，SC/T-7232-2020》。在这个《规程》中，规定了对虾EHP的检测方法，可以采用组织病理学方法和PCR方法（套式PCR和荧光定量PCR）检测危害对虾的EHP。采集患有EHP的养殖对虾，进行组织切片后，研究人员利用染色方法，将对虾组织与EHP区分开来，有实验结果证明适宜的切片厚度可以增加对虾组织中EHP的检出率。迄今为止，研究者采用较多的染色方法依然是苏木精-伊红染色法。但是，有人采用多种染色方法，对患有EHP的对虾组织切片染色，比较其染色效果后指出，能在对虾切片组织中明显区分出EHP的最佳染色方法，是所谓Masson染色法（图2）。
图2患EHP凡纳滨对虾的组织切片经Masson染色法处理后的情景（图片来自网络）所谓PCR检测技术，就是提取待检样品中某种生物的DNA后，在特定的PCR仪中，完成DNA的变性—退火—延伸3个基本反应步骤，让样品中原本微量的DNA片段在这个过程中，获得大幅度地增加后便于检测。正是因为这种检测技术需要的样品量极少、灵敏度和准确度极高的缘故，该技术在现代医学及生物学研究中，得到了广泛地应用。值得注意的是，利用PCR技术检测到的是材料中存在的某种生物的遗传物质DNA，其优点是只要检测样品存及微量的DNA，就可以利用PCR技术将其检查出来。存在的问题是检测到样品中的DNA，究竟是来自样品中尚活着的某种生物，还是样品中已经死亡的生物体遗骸中的DNA？PCR技术是无法区分并做出自行判断的。做出科学地判断尚需要具有相关专业知识的技术人员完成。为什么检测机构将对虾饲料作为病原生物的检测样品是不合理的？原因就是饲料厂家在生产对虾饲料时，为了确保对虾饲料的质量和养殖对虾能正常、快速地生长，将鱼粉作为动物蛋白源添加在对虾饲料中。制作鱼粉的鱼类在其生活水域中，是可能存在被EHP感染的。在鱼粉的加工过程中，虽然其体内存在的EHP在经过高温等鱼粉制作过程中被杀死了，但是EHP的DNA还是存在于鱼粉中，而不会因为高温等鱼粉加工环境因素而受到破坏的。这些原本存在于鱼粉中的EHP的DNA物质，随着饲料生产者将带有EHP的DNA物质的鱼粉添加到对虾饲料中，对虾饲料中也就有了EHP的DNA物质。因此，疫病监测技术人员利用PCR技术检测到EHP的DNA物质，也就不奇怪了！不过，根据《虾肝肠胞虫诊断规程，SC/T-7232-2020》中对采样对象的的规定，检测致病性EHP时，采样对象应该是凡纳滨对虾、斑节对虾、日本囊对虾等养殖对虾，还可以是轮虫、卤虫等容易携带EHP的饵料生物。依据“中华人民共和国水产行业标准”中规定的虾肝肠胞虫的检测样品，并不包括人工制造的对虾饲料。也就是说，采用PCR技术检测对虾饲料中的EHP的DNA物质，并且将检测结果判为阴性或者阳性，是极不合理的！也是不科学的！为了避免导致水产养殖业者的困惑，建议各地水产动物疫病检测机构，立即停止这种错误的做法。
转载声明
本文版权属于农财宝典（ncbd0000），未经授权，谢绝转载。
作者：华中农业大学 陈昌福 。
编辑：郑燕云（手机/微信号zhengyyun11，新闻爆料、转载授权请加微信）
